PCR仪专题
PCR仪主要适用于医学、司法科学、生物技术、分子生物学、环境科学、临床诊断、流行病学、遗传学、基因检测等领域。PCR仪可分为梯度PCR仪、原位PCR仪、实时荧光定量PCR仪、普通PCR仪。下面将为您详细介绍PCR仪：
一、PCR仪分类
1.梯度PCR仪：是由普通PCR仪衍生出的带梯度PCR功能的基因扩增仪。PCR反应能否成功，退火温度是关键，梯度PCR仪每个孔的温度可以在指定范围内按照梯度设置，根据结果，一步就可以摸索出[much]适反应条件。
2.原位PCR仪：可用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪，可保持细胞组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置上进行基因扩增。
3.实时荧光定量PCR仪：它的的发明实现了荣获诺贝尔化学奖的PCR核酸检测、分子诊断的技术飞跃。是在普通PCR仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统，就成了荧光定量PCR仪。
4.普通PCR仪：可应用于科研研究，教学，医学临床，检验检疫等机构，对目的基因退火温度的扩增。
二、PCR技术的应用举例
1.研究：基因克隆;DNA测序;分析突变;基因重组与融合;鉴定与调控蛋白质结合DNA序列;转座子插入位点的绘图;检测基因的修饰;合成基因的构建;构建克隆 或表达载体;检测某基因的内切酶多态性。
2.免疫学：HLA分裂;T细胞受体或抗体多样化的定性;自身免疫病基因作图;淋巴因子定量
人类基因组工程：用散布重复序列产生DNA标志;遗传图谱的构建(检测DNA、 多态性或精子绘图);物理图谱的构建;测序，表达图谱。
3.诊断：细菌(螺旋体、支原体、衣原体、分支杆菌、立克次氏体、白喉杆菌、致病大肠杆菌、痢疾杆菌、嗜水气单胞菌和艰难梭菌等);病毒(HTLV、HIV、 HBV、 HPVS、EV、CMV、EBV、HSV，麻疹病毒、轮状病毒、细小病毒B19);寄生虫(疟疾 等);人遗传病(Lesh-Nyhan综合症、地贫、血友病、BMD、DMD、囊性纤维化等)。
4.法医：犯罪现场标本分析;HLA-DQ。
5.肿瘤：胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤。
6.组织和群体生物学：遗传聚类研究;动物保护研究;生态学;环境科学;实验遗 传学古生物学：考古与博物馆标本分析。
7.动物学：动物传染病的诊断等
8.植物学：检测植物病原等
三、PCR仪使用说明：
（一）试剂PCR仪
1.引物：决定扩增的特异性。根据检测的DNA不同，选用不同引物，每种病原微生物都有自己特异的引物。
2.耐热的DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温90℃-100℃。
3.10×PCR缓冲液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl（pH8.4,20℃）150mmol/L MgCl2,1mg/ml明胶。10×PCR缓冲液随酶一起购买。
4.5mmol/L dNTP贮备液：将dATP、dCTP、dGTP和dTTP钠盐各100mg合并，加入灭菌去离子水溶解，用NaOH调pH至中性，分装每份300μl，-20℃保存。dNTP浓度理想地用UV吸收法[accurate测定。现用dNTP溶液均有商品化产品。
5.DNA模板：用处理液将待测标本处理，不同处理方法、操作各异，但目的是暴露标本中被检测的DNA。
（二）操作程序PCR仪
过去标准的PCR操作程序是将PCR仪必需反应成份分别加入一微量离心管中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。具体如下：
1.向一微量离心管中依次加入
DNA模板 102-105拷贝
引物 各1μmol/L
dNTP 各200μmol/L
10×PCR缓冲液 1/10体积
ddH2O 补到终体积（终体积50μl-100μl）
混匀后，离心15s使反应成分集于管底。以上步骤仅在实验研究用，现在商品化试剂已将dNTP、10×PCR缓冲液，引物，ddH2O混合在一起，反应体积为20-25μl，只要试验人员加入处理好的样品就可以了。
2.加石蜡油50-100μl于反应液表面以防蒸发。置反应管于97℃变性10min。
3.冷至延伸温度时，加入1-5u Taq DNA聚合酶，离心30s使酶和反应液充分混合。现在临床使用试剂酶通常已加入反应液中。
4.PCR仪的循环程序为：94℃变性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循环30-35次。[much]后一次循环结束后，再将反应管置72℃温育5min，以确保充分延伸。
PCR仪尚可用于组织标本DNA的扩增。由于固定组织标本的DNA常发生降解，就给常用的分析方法如Southern转印杂交等带来一定困难。
在应用PCR方法检测RNA病毒时，首先应将RNA转化成cDNA才能进行扩增，因为PCR只能对DNA模板进行扩增，我们把这种RNA的PCR反应称为反转录PCR，简称RT-PCR。把由RNA转化成DNA的过程叫做反转录，反转录需要在反转录酶的作用下完成。
四、PCR仪详细操作步骤：
1、开机：打开开关，视窗上显示“SELF TEST”，显示10秒中后，显示RUN-ENTER菜单： “-RUNENTER PROGRAM PROGRAM ”准备执行程序。
2、放入样本管，关紧盖子。
3、如果要运行已经编好的程序，则直接按《Proceed》，用箭头键选择已储存的程序，按《Proceed》，则屏幕显示：“- ENABLE DISABLE HEATED LID” 按《Proceed》选择ENABLE，则开始执行程序。
4、如果要输入新的程序，则在RUN-ENTER菜单上用箭头键选择ENTER PROGRAM，按《Proceed》，屏幕显示 “ -NEWLIST EDITDELET”，按《Proceed》
1）选择NEW，命名新的程序，[much]多8个字母，输入后按《Proceed》确认。
2）输入程序步骤：名字输入后，显示“ STEP1 _TEMP GOTO OPITON END”，按《Proceed》则可以输入温度（0～100℃），按《Proceed》确认后，则可以输入孵育时间，用《Select》键移动光标，输入数字，完成后按《Proceed》确认，跳到下一步，输入方式同上。
3）选择GOTO，输入循环步骤时链接到第几步（循环数[much]多可达9999次）（为实际循环数-1)。
4) 选择option，显示“ STEP EXTENDI NCREMENT SLOPE ”再选择increment，按《Proceed》确认，输入初始的温度，确认后输入时间，按《Proceed》确认，然后输入每个循环增加或减少的温度，增加用正值，减少用负值（-0.1℃～6℃），按《Proceed》确认。选择extend，按《Proceed》确认，输入每个循环增加或减少的时间（-60～60秒），按《Proceed》确认。
选择slop（指温度上升或下降的速率），输入温度的改变值（-0.1～1.5℃）按《Proceed》确认，然后输入加热或致冷的速度，按《Proceed》确认。
4）选择End，输入结束步骤。
5、输入完成的程序后，到RUN-ENTER菜单，选择新程序，开始运行。
6、其它：用《pause》可以暂停一个运行的程序，再按一次继续程序。用《stop》或《Cancel》可停止运行的程序。
五、PCR仪使用注意事项：
1. PCR仪应放置在水平坚固的平台上，外界电源系统电压要匹配，并要求有良好的接地线。
2.环境温度保持在23℃左右，湿度保持在60％左右。
3.应配备功率≥3000W的稳压器。
4.应定期清洁维护。
5.使用时应严格遵守上述使用步骤。
六、PCR仪维护保养方法：
1.样品槽应每月定期进行清理（在样品槽中加入少量95％乙醇，用棉签擦洗反应孔，用干棉签吸干乙醇）。
2.每月应定期对热盖进行清洁。
3.校正ROI光路以便确信结果仍然是优化的。
4.每月检查样品槽的荧光污染，如有需要随时进行。
七、PCR仪常见故障处理方法：
1.使用PCR管，反应后部分PCR管内反应液有明显蒸发
解决方法：a.确保使用高质量的PCR管或使用我们推荐的PCR管
b.在样品台的四角放置四个同样的空PCR管，以保证热盖压在各PCR管上的压力均匀
2. 使用的微孔板，反应后反应液有明显蒸发
a.确保使用高质量的微孔板，反应前要严格密封
b.确保盖紧热盖，适当提高热盖的温度
c.增大反应体积
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